EOS 80D配备了新的45点自动对焦系统，对焦点数量有了大幅度增加，同时自动对焦覆盖区域在横向和纵向也均得到了扩展。45个对焦点全部可选且均为十字型自动对焦感应器，其中最多27点可支持F8光圈，即使使用增倍镜搭配镜头拍摄，也能实现自动对焦。此外，中央1点还增加了可对应F2.8光圈的斜向十字型对焦感应器，从而组成可实现更高精度的双十字型自动对焦感应器，当使用大光圈镜头拍摄时，能实现更高的对焦精度。同时，中央对焦点在低亮度下的对焦界限为-3EV，在较为昏暗的场景中也能自动对焦。

EOS 80D搭载的7560像素 RGB+红外 测光感应器可以检测被摄人物的肤色，因此用户在拍摄人像时，即使画面前景有物体干扰，相机依然可以准确判断并将焦点锁定在人脸部，减少人物脱焦的情况。EOS 80D的人工智能伺服自动对焦II也可提升拍摄对象的追踪效果。在实时取景模式下，EOS 80D则可通过全像素双核 CMOS AF进行快速高精度的对焦，并支持伺服自动对焦，拥有最高约5张/秒的高速连拍性能，触摸快门使合焦与拍摄能够几乎同时进行，即使是小孩子也能轻松完成。

该机提供了4种能灵活运用45个自动对焦点的对焦区域选择模式，分别为单点对焦、区域自动对焦、大区域自动对焦以及45点自动对焦自动选择，用户可根据不同场景区分使用，能有效提高对焦效果。此外，用户还可分别设置横向或纵向持机时的自动对焦区域选择模式和自动对焦点，而利用自动对焦微调功能可对每一支镜头的焦点进行位置微调。